مقاله user873

فصل دوم مروری بر مطالعات انجام شده2-1 مطالعات انجام شده بر روی ژن کاتالاز PAGEREF _Toc398892188 h 142-2 مطالعات انجام شده بر روی ژن NQO1 PAGEREF _Toc398892189 h 172-3 مطالعات پیشین انجام شده در خصوص پیوند کبد: PAGEREF _Toc398892190 h 18فصل سوم روش کار3-1 نمونه گیری: PAGEREF _Toc398892192 h 213-2 وسایل مورد نیاز PAGEREF _Toc398892193 h 223-2-1 محلولهای استفاده شده جهت استخراج DNA از نمونه خون کامل PAGEREF _Toc398892194 h 223-2-2 محلولهای استفاده شده جهت استخراج DNA از نمونه بافی کت PAGEREF _Toc398892195 h 223-2-3 مواد لازم جهت انجام PCR PAGEREF _Toc398892196 h 223-2-4 مواد لازم جهت انجام الکتروفورز PAGEREF _Toc398892197 h 223-2-5 مواد استفاده شده جهت اثر دادن آنزیم محدود کننده PAGEREF _Toc398892198 h 233-3 استخراج DNA از خون محیطی PAGEREF _Toc398892199 h 233-4 استخراج DNA از بافی کت با کیت DNP PAGEREF _Toc398892200 h 233-5 PCR PAGEREF _Toc398892201 h 243-6 الکتروفورز PAGEREF _Toc398892202 h 273-7 رنگ آمیزی ژل PAGEREF _Toc398892203 h 283-7 تحلیل آماری PAGEREF _Toc398892204 h 29فصل چهارم نتایج4-1 مشخصات افراد شرکت کننده در این مطالعه PAGEREF _Toc398892206 h 314-2 نتایج حاصل از بررسی ریسک فاکتور های دخیل در رد پیوند کبد و مشخصات بیماران PAGEREF _Toc398892207 h 31عنوان صفحه
4-3 نتایج حاصل از بررسی چند شکلی ژن CAT درافراد سالم و بیماران پیوند کبد PAGEREF _Toc398892208 h 334-4 مقایسه ی فراوانی ژنوتیپی و آللی بین دو گروه سالم و بیمار در ژن کاتالاز PAGEREF _Toc398892209 h 344-5 مقایسه ی فراوانی ژنوتیپی و آللی بین بیماران با رد حاد پیوند و بیماران فاقد رد حاد پیوند در ژن کاتالاز PAGEREF _Toc398892210 h 354-6 نتایج حاصل از بررسی چند شکلی ژن NQO1 درافراد سالم و بیماران پیوند کبد PAGEREF _Toc398892211 h 354-7 مقایسه ی فراوانی ژنوتیپی و آللی بین دو گروه سالم و بیمار ژن NQO1 PAGEREF _Toc398892212 h 364-8 مقایسه ی فراوانی ژنوتیپی و آللی بین بیماران با رد حاد پیوند و بیماران فاقد رد حاد پیوند در ژن NQO1 PAGEREF _Toc398892213 h 37فصل پنجم بحث و نتیجه گیری5-1 بحث و نتیجه گیری PAGEREF _Toc398892215 h 395-2 پیشنهادات: PAGEREF _Toc398892216 h 43 فهرست منابع PAGEREF _Toc398892217 h 44
فهرست جدول‌ها
عنوان صفحه
TOC o "1-3" h z u جدول3-1: مشخصات گروه شاهد و کنترل PAGEREF _Toc274765909 h 21جدول 3-2: مواد مورد نیاز جهت تهیه مخلوط واکنش PCR PAGEREF _Toc274765910 h 24جدول 3-3: برنامه تنظیم شده برای واکنش PCRجهت تکثیر ژن NQO1 PAGEREF _Toc274765911 h 25جدول 3-4: قطعات حاصل از هضم آنزیمی برای ژنوتیپ های چندشکلی ژنتیکی NQO1 PAGEREF _Toc274765912 h 26جدول 3-5: برنامه تنظیم شده برای واکنش PCRجهت تکثیر ژن CAT PAGEREF _Toc274765913 h 26جدول 3-6: قطعات حاصل از هضم آنزیمی برای ژنوتیپ های چندشکلی ژنتیکی CAT PAGEREF _Toc274765914 h 27جدول 1-4 بررسی ریسک فاکتورهای دخیل در رد پیوند کبد و مشخصات بیماران PAGEREF _Toc274765919 h 32جدول 2.4- بررسی ریسک فاکتورهای کمی دخیل در رد پیوند کبد و مشخصات بیماران PAGEREF _Toc274765920 h 32جدول 4-3 مقایسه ژنوتیپ های ژن کاتالاز در گروه سالم و بیمار پیوند کبد PAGEREF _Toc274765921 h 33جدول 4-4 آنالیز توزیع فراوانی های ژنوتیپی و آللی ژن کاتالاز PAGEREF _Toc274765922 h 34در بین گروه سالم و بیماران پیوند کبد PAGEREF _Toc274765923 h 34جدول 4-5 آنالیز توزیع فراوانی های ژنوتیپی و آللی در ژن کاتالاز در بین بیماران پیوند کبد PAGEREF _Toc274765924 h 35جدول 4-6 مقایسه ژنوتیپ های ژن NQO1 در گروه سالم و بیمار پیوند کبد PAGEREF _Toc274765925 h 36جدول 4-7 آنالیز توزیع فراوانی های ژنوتیپی و آللی ژنNQO1 در بین گروه سالم و بیماران پیوند کبد PAGEREF _Toc274765926 h 36جدول 4-8 آنالیز توزیع فراوانی های ژنوتیپی و آللی در ژن NQO1 در بین بیماران پیوند کبد PAGEREF _Toc274765927 h 37
فهرست شکل‌ها
عنوان صفحه
شکل 3-2: نتایج حاصل از PCR -RFLP چند شکلی ژنتیکی NQO1 C609T بر روی ژل آگاروز PAGEREF _Toc274765918 h 29شکل 3-1: نتایج حاصل از PCR –RFLP چند شکلی ژنتیکی CAT C-262T بر روی ژل آگاروز PAGEREF _Toc274765916 h 28شکل 1-1 ساختار ژن CAT و چندشکلی ژنتیکی CATC-262T PAGEREF _Toc274765907 h 10شکل 2-1- ساختار ژن NQO1 و چند شکلی ژنتیکی NQO1 C609T PAGEREF _Toc274765908 h 11فصل اول
مقدمه1-1 کبدکبد یکی از پرکارترین اعضای بدن است که بسیاری از فعالیت های حیاتی در آن انجام می شود یکی از کارهای مهم آن سم زدایی است. در سم زدایی، کبد مواد نامحلول را به مواد بی خطر و محلول در آب تبدیل و به ادرار یا صفرا منتقل می کند ((Liska et al, 1998.
سم زدایی شامل دو مرحله است:
در مرحله اول خانواده سیتوکروم P450 نقش بسیار مهمی را بازی می کنند که اولین دفاع آنزیمی در برابر ترکیبات خارجی است. این آنزیم ها با استفاده از اکسیژن و کوفاکتور NADPH، گروه فعالی مثل OH را به مواد اضافه کرده و باعث تولید مواد قطبی می شوند که امکان دارد از حالت اولیه خود بسیار خطرناک تر باشند. اگر این مولکول ها توسط مرحله دوم خنثی نشوند امکان دارد به پروتئین ها, DNA یا RNA سلول ها آسیب بزنند. در این مرحله رادیکال های آزاد نیز تشکیل می شوندLiska et al, 1998) ( Vermeulen NPE et al, 1994,.
مطالعات بسیاری رابطه بین فاصله زمانی بین این دو فاز با ابتلا به بیماری هایی مثل سرطان را بررسی کرده اند .(Meyer UA et al, 1990)اگر فاصله زمانی این دو فاز زیاد باشد یا آنزیم های فاز دو به علت افزایش بیش از حد مواد اشباع باشند صدمات جبران ناپذیری به کبد وارد می شود ((Liska D et al, 1998.
در مرحله دوم سلول های کبد موادی مانند گلوتاتیون، سولفور و اسید آمینه را به مواد حاصل از مرحله یک اضافه و باعث افزایش حلالیت آنها در آب یا صفرا می شوند .گلوتاتیون از موادی است که باعث خنثی شدن رادیکال های آزاد و مواد حاصل از مرحله یک می شود و حضور آن برای بدن ضروری است. اگر متابولیت های حاصل مرحله یک به حدی زیاد باشند که مقدار گلوتاتیون ها برای خنثی سازی آنها کافی نباشد، کبد آسیب می بیند. از آنزیم های مهم این فاز گلوتاتیون s- ترانسفرازها هستند که اتصال گلوتاتیون به محصول مرحله یک را کاتالیز می کنند (Liska (et al, 1998.
آسیب به کبد گاهی باعث از دست رفتن بافت کبد می شود. بیماری های متفاوتی مانند سیروز، هپاتیت و ... می تواند باعث این امر شود. سیروز به التهاب شدید کبد می گویند و از نظر پاتولوژی مشخصات معینی دارد که از دلایل عمده آن می توان به الکلیسم و بیماری هپاتیت C اشاره کرد. درمان در موارد پیشرفته بیماری های کبدی با پیوند کبد است.(Mazzeferro V et al, 1996) زمانی که به هر دلیلی عملکرد کبد دچار اختلال شود و این اختلال برگشت پذیر نباشد پیوند کبد مطرح می شود. از مهمترین چالش های پیش روی پیوند کبد رد پیوند است که باعث کاهش موفقیت در این روش درمانی می شود.
1-2 رد پیونداصلیترین علت عدم موفقیت در پیوند، پاسخ سیستم ایمنی فرد گیرنده در برابر بافت اهداشده است. چنانچه گیرنده آلوگرافت کبد، دارای سیستم ایمنی کاملا سالمی باشد، عمل پیوند تقریبا در تمامی موارد منجر به نوعی از رد میشود. رد پیوند پروسهای با مکانیسمهای متفاوت است. آنتیبادیها، سیستم کمپلمان، سلولهای T و سایر انواع سلولی در رد پیوند دخیل هستند ( et al, 2011 Gavela Martínez). آلوآنتی ژنها هر دو دسته پاسخهای ایمنی با واسطه سلولی و همورال را برمیانگیزند. با توجه به پیشینه رد پیوندهای کبدی، الگوی هیستوپاتولوژیک رد پیوند را به سه دسته فوق حاد، حاد و مزمن طبقه بندی میکنند (Abbas et al, 2011).
1-2-1 رد فوق حاداین شکل از رد پیوند در فاصله زمانی کوتاهی بین چند دقیقه تا چند ساعت بعد از پیوند با واسطه سیستم ایمنی هومورال اتفاق میافتد. در این شرایط تورم، ترومبوز عروقی، خونریزی و انفارکتوس در گرافت دیده میشود. این واکنشها از فعالیت آنتیبادیهای سیستم کمپلمان و سلولهای اندوتلیال گرافت ناشی شده و باعث تغییرات پیش انعقادی و در نتیجه از بین رفتن بافت میشوند (Al-rabia, 2009).
1-2-2 رد حاد
سلولهای T و آنتی بادیها معمولا پس از اولین هفته پیوند، باعث ایجاد نوعی آسیب عروقی و پارانشیمی میشوند که رد حاد نام میگیرد. مطالعات در سویههای خالص موش نقش محوری مولکولهای کمک تحریکی و کموکاینها را در رد حاد پیوند نشان داده است. برخی از واسطههای التهابی به عنوان مثال، IFNγ میتوانند حساسیت پیوند به آسیب را تغییر دهند (Cornell et al, 2008).
1-2-3 رد مزمندر پیوندهای دارای عروق که بیش از شش ماه باقی ماندهاند با تکثیر سلولهای عضلانی صاف، انسداد شریانی به آرامی گسترش مییابد و در نهایت موجب آسیب ایسکمیک و رد پیوند میشود. از ویژگیهای این نوع رد پیوند کاهش پیشرونده عملکرد کبدی، حمله به پارانشیم کبد توسط سلول های T و نفوذ مداوم مایعات میان بافتی توسط سلول های T و ماکروفاژها است (Cornell et al, 2008). رد مزمن در بافتهای مختلف شواهد فیزیولوژیکی گوناگونی را نشان میدهد.
1-2-4 رد حاد پیوند کبداز انواع مهم رد حاد پیوند میتوان به رد حاد با واسطه آنتیبادیها و رد حاد با واسطه سلولهای T اشاره کرد. رد حاد با واسطه آنتیبادی اغلب از چند روز تا چند هفته پس از پیوند آغاز میشود. اولین نشانه در این نوع از رد پیوند اختلال سریع در عملکرد گرافت ناشی از التهاب است. با عملکرد آنتیبادیهایی که از قبل در بدن وجود دارند، فعالیت سیستم کمپلمان علیه گرافت آغاز میشود. هدف اصلی این آنتیبادیها MHC های سطحی سلولهای اندوتلیال و مویرگهای گرافت هستند( Nankivell et al, 2010).
رد حاد سلولی با تجمع سلولهای تک هستهای در فضای میان بافتی و التهاب شریانها مشخص میشود. اکثر سلولهای تک هستهای که در فضای میان بافتی نفوذ میکنند، سلولهای T CD4+ و CD8 + هستند. رد حاد پیوند کبد شامل التهاب شدید بافت پیوندی است که ابتدا روی مجاری صفراوی، سلول های اندوتلیال، سیاهرگ پورتال و رگ های کوچک کبدی اثر می گذارد و گاهی شامل سرخرگ کبدی و انشعابات آن نیز می شود. رد پیوند حاد به دو صورت کلینیکی و بافتی قابل تشخیص است. نوع کلینیکی با علائمی مثل تب، یرقان و گاهی بزرگ شدن شکم همراه است. در این زمان میزان آنزیم های کبدی مانند آلانین آمینو ترانسفراز، آسپارتات آمینوترانسفراز، بیلی روبین کل و بیلی روبین مستقیم، دچار تغییر می شوند. در نوع بافتی انجام بیوپسی از بافت تایید کننده رد پیوند است که علائم آن عبارت است از:
الف-تخریب و التهاب سیاهرگ پورتال، افزایش تعداد لنفوسیتهای فعال،نوتروفیل و ائوزینوفیل
ب- تخریب و التهاب مجاری صفراوی ج- التهاب بافت زیر اندوتلیال سیاهرگ پورتال.
حداقل دو مورد از سه ویژگی بالا برای تایید ردحاد پیوند مورد نیاز است. با بروز علائم رد حاد پیوند از داروهای سرکوب کننده بیشتری استفاده می کنند (Banff, 1996). با درمانهای فعلی، بروز رد حاد حدود 5 تا 10 درصد در سال اول در بیماران کاهش مییابد (Cornell et al, 2008).
1-2-4-1 اپیدمیولوژی رد حاد پیوند کبدبا ساخت و کشف داروها و روش های متفاوت و کارآمد در پیوند کبد میزان بقا بیماران پیوندی به 80 درصد در یک سال رسیده است.( Cristina A et al,1999) تعدادی از عوامل که بقاء کوتاه مدت پیوند را تحت تأثیر قرار میدهند عبارتند از: عملکرد تأخیری پیوند (DGF) ، آنتی بادی های ضد HLA، نوع اهدا کننده پیوند، گروه خونی، افزایش سن دهنده و گیرنده پیوند، وزن گیرنده، فشار خون بالا، دیابت و... از عوامل خطر قابل توجه برای از دست دادن پیوند میباشند که برخی از این عوامل را به اختصار توضیح میدهیم.

1-2-4-1-1 آنتی بادیهای ضد HLAپاسخهای خود ایمنی عمدتأ علیه مولکول های سطح سلول که تحت عنوان مولکولهای MHC خوانده می شوند، انجام میگیرد. مولکولهای MHC در انسان آنتیژن لکوسیت انسانی (HLA) نامیده میشوند. این مولکولها مسئول ارائه آنتیژنهای خارج و داخل سلولی به سلولهای سیستم ایمنی از جمله سلولهای T هستند. سلولهای T قادرند مولکول MHC خارجی سلولهای پیوندی (به طور مستقیم) یا بعد از پردازش مجدد در سطح گیرنده سلولهای عرضه کننده آنتیژن (غیر مستقیم) تشخیص بدهد. بدن به طور معمول به مولکول های MHC که از قبل در بدن وجود داشته پاسخ نمیدهد مگر اینکه از طریق بارداری، انتقال خون یا پیوند در معرض سلولهای خارجی قرار بگیرند. هر چه میزان سازگاری مولکولهای MHC دهنده با گیرنده بیشتر باشد سیستم ایمنی میزبان کمتر تحریک شده و پایداری بافت افزایش مییابد (Morris PJ et al, 2004). اهمیت آنتیژنهای MHC در انسان بدیهی است به طوری که میزان طول عمر بقای پیوند در پیوندهای خواهر برادری با HLA مشابه به طور قابل توجهی بالاتر از پیوند خواهر برادری با HLA غیرمشابه میباشد. (Nankivell BJ et al, 2010) تقریبأ 25 % از رد حاد به علت آنتیبادی علیه آنتیژنهای HLA دهنده صورت میگیرد (Colvin RB et al, 2007).
1-2-4-1-2 آنتی بادی علیه آنتی ژنهای گروه خونیدر پیوند کبد، گروه خونی دهنده کبد به طور معمول با گروه خونی گیرنده سازگار است. با این حال، پیوند کبد در گیرندههایی که با فرد دهنده از نظر گروه خونی ناسازگاراند نیز با موفقیت، با استفاده از یک پروتکل تجربی پلاسمافرز یا immunoadsorption که مستلزم حذف آنتیبادی در گیرنده پیوند بعد از عمل است، صورت میگیرد. پس از حذف، آنتی بادیهای ضد گروه خونی به سطح قبل از پیوند افزایش مییابند .(Lynch RJ et al, 2008)
1-2-4-1-3 افزایش سن اهداکننده و دریافت کننده پیونددر مطالعهای که در سال 2010 بر روی عوامل خطر مؤثر در از دست رفتن پیوند انجام شد، نتایج نشان داد که سن اهدا کننده یک عامل پیش آگهی و قابل توجه برای از دست رفتن پیوند است، بدین صورت که با افزایش یک سال در سن دهنده، خطر نسبی از دست رفتن پیوند 05/1 برابر افزایش مییابد .(Khalkhali HR et al, 2010)
1-2-4-1-4 اهدا کننده بافتاینکه بافت پیوندی از فرد زنده دریافت شده باشد یا از فرد دچار مرگ مغزی، در بقای طولانی مدت پیوند تأثیرگذار خواهد بود. به طوری که در بیمارانی که از فرد زنده و به خصوص از خویشاوندان درجه اول بافت میگیرند رد پیوند کاهش مییابد. تا سال 1387 در حدود 95-90 % کل پیوند اعضاء از اهدا کنندگان زنده و 5 تا 10 درصد آن از طریق پیوند از جسد انجام میگرفت، در حال حاضر، 96 درصد پیوندها از جسد و تنها حدود 4 درصد از پیوندها از اهدا کننده زنده دریافت میشود. در خصوص پیوند کبد در اغلب موارد بافت پیوندی از جسد گرفته می شود مگر در مواردی که دریافت کننده کودک باشد. همچنین مطالعات انجام شده در این خصوص حاکی از آن است که حدود 50-20 %، وقوع DGF در بیمارانی که از جسد بافت دریافت میکنند افزایش مییابد که ناشی از اثرات سیستمیک مرگ مغزی دهنده یا آسیب اسیکمی- ریپرفیوژن حین عمل میباشد.(HYPERLINK "http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Nankivell%20BJ%22%5BAuthor%5D"Nankivell BJ et al, 2010, Giral Classe M et al, 1998)
1-3 استرس اکسیداتیو و آنتی اکسیدانت هااسترس اکسیداتیو در نتیجهی افزایش غلظت گونههای فعال اکسیژن (ROS) و یا کاهش آنتی اکسیدانتها صورت میگیرد. (Crawford DA et al, 2011) که نشان دهندهی عدم تعادل در میزان تولید رادیکالهای آزاد و توانایی سیستم دفاع آنتی اکسیدانی در رفع واسطههای واکنش (ROS) و یا ترمیم آسیب به وجود آمده می باشد. اثرات سمی ناشی از استرس اکسیداتیو که از طریق تولید پراکسیدها و رادیکالهای آزاد ایجاد میشود به تمام اجزای سلول از جمله: پروتئینها، لیپیدها و DNA آسیب میرساند. علاوه بر این، گونههای فعال اکسیژن به عنوان یک عامل پیامرسان در سیگنالینگ اکسید و احیاء عمل میکنند، بنابراین استرس اکسیداتیو میتواند باعث اختلال در مکانیسمهای طبیعی سیگنالینگ سلولی شود.
در انسان استرس اکسیداتیو در توسعه سرطان (Barry H et al, 2007)، بیماری پارکینسون و آلزایمر (Valko M et al, 2007)، آترواسکلروز، نارسایی قلبی (Singh N et al, 1995)، سندرم x شکننده (Diego-Otero Y et al, 2009)، بیماری خونی سلول داسی شکل (Amer J et al, 2006) و چند بیماری دیگر دخیل است. استرس اکسیداتیو شدیدتر میتواند باعث مرگ سلولها شود، استرس اکسیداتیو در حد متوسط میتواند آپوپتوز را آغاز کند، در حالیکه تنشها شدیدتر باشد ممکن است باعث نکروز شدن گردد (Lennon SV et al, 1991). برای حفظ عملکرد سلولی در برابر ROS، سلولها سیستم دفاعی آنزیمی (به عنوان مثال: سوپر اکسید دیسموتاز، کاتالاز و گلوتاتیون پراکسیداز) و غیر آنزیمی (به عنوان مثال: گلوتاتیون و ویتامین هایی با نقش آنتی اکسیدان مثل ویتامین C و E) دارند که به وسیله ی آن ROS راسم زدایی میکنند (Abdollahi M et al, 2004)0
1-3-1 کاتالازکاتالاز آنزیم مشترک در تقریبأ تمام موجودات زنده هوازی میباشد که تجزیه پراکسید هیدروژن (H2O2) به آب و اکسیژن را کاتالیز میکند. (Chelikani P et al, 2004) کاتالاز مجموعهای از چهار زیر واحد یکسان (تترامر) است که هر زیر واحد آن دارای وزن مولکولی در حدود 60 کیلو دالتون میباشد و هر زیر واحد دارای یک گروه هِم میباشد. (Nagem R et al, 1999)
ژن کاتالاز 34 کیلو جفت باز طول دارد و شامل 12 اینترون و 13 اگزون می باشد. بخش پروموتر ژن کاتالاز غنی از GC و فاقد جعبهی TATA میباشد. ژن کاتالاز انسان بر روی بازوی کوتاه کروموزوم شماره 11 در موقعیت 13 این ژن (13P11) قرار گرفته است. (Quan F et al, 1986) تومور ویلمز (Wilm’s Tumor) یک نئوپلاسم رایج دوران کودکی است که با حذف در اطراف باند 13P کروموزوم 11 همراه است. در بعضی از افراد حذف با کاهش فعالیت آنزیم کاتالاز همراه است. در بافت پستانداران بالاترین سطح آنزیم کاتالاز در کبد، کلیه و گلبول های قرمز و پایین ترین سطح آن در بافت همبند یافت میشود. Shinga و همکارانش گزارش کردند که در سلولهای عضله صاف عروق و سلول های اندوتلیال آنزیم کاتالاز فاقد فعالیت میباشد. در بافت کبد کاتالاز به طور غالب در پراکسیزومها و در اریتروسیتهای بالغ بصورت آزاد در سیتوزول وجود دارد.(Quan F et al, 1986)
تجزیه پراکسید هیدروژن به آب و اکسیژن بوسیله ی آنزیم کاتالاز، یک فرآیند دو مرحلهای است:
1)H2O2 + Fe(III)-E → H2O + O=Fe(IV)-E
2)H2O2 + O=Fe(IV)-E → H2O + Fe(III)-E + O2
با وارد شدن پراکسید هیدروژن به جایگاه فعال آنزیم کاتالاز، با اسید آمینه های 147Asn و 74His برهمکنش میکند و باعث انتقال پروتون (یون هیدروژن) بین اتم های اکسیژن میشود که این انتقال یون هیدروژن به اتم های اکسیژن آزاد سبب تشکیل یک مولکول آب میشود و Fe3+ به Fe4+ تبدیل میشود. Fe4+ با دومین مولکول هیدروژن پراکسید واکنش داده، آب و اکسیژن تولید میکند و به Fe3+ تبدیل میشود .(Vetrano AM et al, 2005)
تعدادی چند شکلی در ژن کاتالاز گزارش شده که بیشتر آنها با آکاتالاسمیا که یک صفت آتوزومال غالب بوده و سطح آنزیم کاتالاز گلبولهای قرمز 2/0-4 % بالاتر از حد نرمال است، همراه میباشد (Ogata M et al, 1991).
چند شکلی که در این مطالعه مورد بررسی قرار دادیم، جایگزینی باز سیتوزین به تیمین در موقعیت 262- پروموتر ژن کاتالاز بود که افراد حامل آلل T (CT, TT) نسبت به افراد هموزیگوت برای آلل C(CC) به طور قابل توجهی سطح کمتری از آنزیم کاتالاز را نشان میدهند .(Ahn J et al, 2006)
ساختار ژن CAT و جایگاه چند شکلی مورد نظر در شکل زیر آمده است.

شکل 1-1 ساختار ژن CAT و چندشکلی ژنتیکی CATC-262T1-3-2 NAD(P)H کوئینون اکسیدوردوکتاز1 (NQO1):NQO1 یک آنزیم سیتوزولی است که قبلأ تحت عنوان DT-diaphorase نامیده میشد، از آنزیمهای مهم در متابولیسم زنوبیوتیکها به شمار میآید. این آنزیم احیاء دو اکترونی ترکیبات quinoid به هیدروکوئینون را کاتالیز میکند. از تولید رادیکالهای آزاد و گونه های فعال اکسیژنی جلوگیری میکند، در نتیجه از سلولها در برابر آسیب اکسیداتیو محافظت میکند. همچنین فعال سازی برخی از مواد زیست محیطی پیش ساز سرطان موجود در دود توتون و تنباکو مانند ترکیبات نیتروآروماتیک و آمین های هتروسیکلیک را کاتالیز میکند .(Chen H et al, 1999) ژن این آنزیم بر روی موقعیت 22 بازوی بلند کروموزوم شماره 16 (22q16) قرار دارد. طول این ژن 20 کیلو جفت باز است که 5 اینترون و 6 اگزون را در خود جای داده است
.(Ernster L et al, 1987)
چند شکلی مورد بررسی در این مطالعه مربوط به جایگزینی بازهای آلی سیتوزین به تیمین در موقعیت 609 اگزون شماره 6 ژن NQO1 میباشد که اسید آمینه پرولین جایگزین سرین میشود .(Wiencke JK et al, 1997) این چند شکلی با کاهش فعالیت آنزیم همراه است و در 25-13 % ازجمعیت سفید پوستان دیده میشود .(Chen H et al, 1999) به طوری که آنزیم NQO1 در افرادی که ژنوتیپ TT دارند، یا فاقد فعالیت است یا فعالیت کمی دارد.(Siegel D et al, 1999) و افرادی که ژنوتیپ هتروزیگوت (CT) دارند تقریبأ نیمی از فعالیت آنزیم را دارند.
در شکل زیر ساختار و جایگاه چند شکلی ژنتیکی ژن NQO1 آمده است:

شکل 2-1- ساختار ژن NQO1 و چند شکلی ژنتیکی NQO1 C609T1-4 هدفاز آنجا که رد حاد پیوند در حفظ بافت بصورت کوتاه مدت و بلند مدت دارای اهمیت است، مطالعات بسیاری بر روی عوامل ایمنی و غیر ایمنی مؤثر در رد حاد پیوند انجام گرفته است. چند شکلی ژنتیکی تک نوکلئوتیدی (SNP) از معمولترین تنوعات ژنتیکی در ژنوم انسان هستند و پتانسیل زیادی برای کاربرد در بررسی رابطه آن با تعدادی از بیماریها دارد. رادیکالهای آزاد اکسیژن به عنوان واسطههای پاتولوژیک در بسیاری از بیماری ها دخیل هستند. استرس اکسیداتیو با پیشرفت بسیاری از بیماریها از جمله سرطان، بیماریهای عصبی، دیابت و بیماری مزمن کلیوی مرتبط است. یکی از سیستمهای دفاعی علیه آسیبهای ناشی از استرس اکسیداتیو در انسان آنزیم کاتالاز و NQO1 میباشد، از آنجا که استرس اکسیداتیو می تواند در نکروز شدن بافت تأثیر بگذارد، بر آن شدیم تا یک چند شکلی در ژن CAT و یک چند شکلی در اگزون 6 ژن NQO1 را بررسی کنیم. این مطالعه جهت بررسی ارتباط پلی مورفیسمC-262T ژن کاتالاز وC609T ژن NQO1 با رد حاد پیوند کبد در بیماران دریافت کنندهی کبدی پیوندی میباشد.
1-5 فرضیه:ژنوتیپTT و CTنسبت به ژنوتیپ CC در چند شکلی ژنتیکی C-262T ژن CAT خطر رد حاد پیوند کبد را افزایش میدهد.
با افزایش آلل T در ژن CAT، خطر رد حاد پیوند کبد افزایش مییابد.
ژنوتیپ TT و TC از چند شکلی ژنتیکی C609T ژن NQO1 درمقایسه با ژنوتیپ CC خطر رد حاد پیوند کبد را افزایش میدهد.
با افزایش آلل T در ژن NQO1، خطر رد حاد پیوند کبد افزایش مییابد.
فصل دوم
مروری بر مطالعات انجام شده2-1 مطالعات انجام شده بر روی ژن کاتالازمطالعات بسیاری بر روی ژن کاتالاز و رابطه چند شکلیهای ژنتیکی آن با بیماریهای مختلف انجام گرفته است که به شرح زیر میباشد:
در مطالعهای که توسط Ahn و همکارانش در سال 2005 در خصوص ارتباط خطر سرطان سینه و ژنوتیپ کاتالاز و استفاده از میوه و سبزیجات و مکمل های غذایی در جزیره لانگ انجام شد نشان داد که فعالیت بالای ژنوتیپ CC ژن کاتالاز با کاهش 17 % خطر ابتلا به سرطان سینه در مقایسه با افرادی که حداقل یک آلل T دارند (TT,CT) مشاهده شد .(HYPERLINK "http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=Ahn%20J%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=16192345"AhnJ et al, 2005)
مطالعهای در سال 2005 توسط Zhou و همکارانش بر روی دو SNP در پروموتر ژن کاتالاز و ارتباط آن با فشار خون بالا در سفیدپوستان و آمریکاییهای آفریقایی تبار انجام شد. اطلاعات بدست آمده نشان داد که تغییرات ژنتیکی در منطقه پروموتر ژن کاتالاز با استعداد ابتلا به فشار خون بالا در ارتباط است .(Zhou XF et al, 2005)
در مطالعهای که توسط Chistiako و همکارانش در سال 2006 در رابطه با چند شکلی CAT C-262T و ارتباط آن با نوروپاتی دیابتی نوع 1 در روسیه انجام شد، نتایج نشان داد که آللT 262- در ژن کاتالاز علیه توسعه سریع بیماری نوروپاتی دیابتی نوع1 نقش حفاظتی دارد (Chistiako DA et al, 2006).
مطالعهای در سال 2006 توسط Mak و همکارانش در هنگ کنگ چین بر روی بیماران مبتلا به آسم و ارتباط آن با چند شکلیCAT C-262T صورت گرفت که نشان داد، آلل T در جمعیت غیر سیگاری، در برابر بیماری آسم نقش حفاظتی دارد (Mak et al, 2006).
در مطالعهای که توسط Zarbock و همکارانش در سال 2007 در ارتباط با خطر بیماری پسودوگزانتوما- الاستیکوم و چند شکلی ژنتیکی C-262T CAT انجام شد، نشان داد که آلل C در این چند شکلی خطر ابتلا به این بیماری را افزایش میدهد (Zarbock R et al, 2007).
در مطالعه ای که توسط Ji-Yeob Choi و همکاران درسال 2007 در بررسی پلی مورفیسمهای Ala16Val ژن Mn-SOD، C-262T CAT و Pro200Lue ژن GPX1 و خطر ابتلا به سرطان پروستات بر روی مردان با سابقه کشیدن سیگار یا قرار گرفتن در معرض آزبست بودند انجام شد، هیچ ارتباطی بین ژنوتیپهای Mn-SOD، CAT و GPX1 و خطر ابتلا به سرطان پروستات دیده نشد.(Choi JY et al, 2007)
در مطالعهای که توسط Cristiano Capurso و همکارانش در سال 2008 در ارتباط با رابطه چند شکلی C-262T CAT و بیماری آلزایمر انجام شد ، هیچ ارتباطی بین بیماری آلزایمر و این چند شکلی مشاهده نشد (Capurso C et al, 2008).
مطالعهای در سال 2009 توسط Piort Galecki و همکارانش بر روی ارتباط بین چند شکلی عملکردی CAT C-262T و احتمال افسردگی صورت گرفت که نتایج بدست آمده نشان داد هیچ ارتباط معنی داری بین چند شکلی ژن کاتالاز و خطر ابتلا به افسردگی وجود ندارد .(HYPERLINK "http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=Galecki%20P%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=19855359"Galecki P et al, 2009)
در مطالعه ای که بر روی جمعیت مراکش در سال 2010 توسط Sayeh Ezzikouri و همکارانش انجام گرفت، ارتباط چند ژن انتی اکسیدان و خطر سرطان کبد مورد بررسی قرار گرفت. نتایج حاصل نشان داد که در چند شکلی CAT C-262T اختلاف آلل TT در بین گروه شاهد و کنترل معنادار بوده و افراد دارای ژنوتیپ TT دارای ریسک بیشتری برای ابتلاء به سرطان کبد هستند (Ezzikouri S et al, 2010) .
در سال 2010 Grazyna Dutkiewicz و همکارانش در لهستان طی بررسی بر روی افرادی که بافت پیوندی دریافت کرده اند، احتمال ابتلاء به دیابت بعد پیوند را با برخی از چند شکلی ها از جمله CAT C-262T مورد آزمایش قرار دادند و یافتند که ارتباط معناداری بین این چند شکلی و خطر ابتلاء به دیابت بعد پیوند وجود ندارد ( Dutkiewicz G et al,2010).
در مطالعه ای که توسط Ozbay و همکارانش در سال 2011 بر روی ارتباط بین سطح آنزیمهای آنتی اکسیدان خون و زمان حمله میگرن در بیماران مبتلا به میگرن انجام شد، کاهش آماری قابل توجهی در فعالیت GST-PX3، CAT، SOD و سطوح GSH در بیماران مبتلا به میگرن در مقایسه با گروه شاهد مشاهده شد.(CAT, GSH P<0/001, GSH, SOD P<0/05) در بیماران مبتلا به میگرن و گروه شاهد تفاوت معنیداری برای ژنوتیپهای Mn-SOD و CAT مشاهده نشد اما در ژنوتیپ GSH-PX3 تفاوت معنیدار وجود داشت. تفاوتی در فراوانی آللی Mn-SOD، CAT و GHS-PX3 در بین بیماران و گروه شاهد نبود. در نتیجه آنزیمهای استرس اکسیداتیو و آنتی اکسیدانت ها ممکن است نقش مهمی در پاتوژنز میگرن ایفا کنند .(Ozbey U et al, 2011)
در مطالعهای که توسط Chang Dong و همکارانش در سال 2012 در ارتباط با چند شکلیCAT -21 A>T با سرطان روده بزرگ انجام شد، تفاوت معنیداری بین ژنوتیپهای ژن CAT و همچنین فعالیت آنزیمی پایین تر در بیماران مبتلا به سرطان روده بزرگ نسبت به گروه کنترل مشاهده شد. فعالیت کم آنزیم CAT با افزایش ریسک ابتلا به سرطان روده بزرگ در ارتباط است، با این حال، هیچ مدرکی در حمایت از ارتباط چند شکلیCAT A-21T با خطر ابتلا به سرطان روده بزرگ مشاهده نشد.(Chang D et al, 2012)
طی مطالعه ای که در سال 2013 توسط Gaynali و همکارانش در ترکیه بر روی افراد سیگاری در دو دسته مبتلا به سرطان حنجره و سالم انجام شد، ارتباط معناداری با چند شکلی CAT C-262T گزارش نگردید ( Aynali G et al, 2013).
طی مطالعه ای که در سال 2014 توسط Natsuko Taniguchi و همکارانش در ژاپن بر روی افراد سیگاری صورت گرفت، ارتباط تعدادی چند شکلی در ژن کاتلاز بررسی شد که طی آن یافت شد ارتباط معناداری بین چند شکلی های CAT C-262T و CAT A-21T و خطر ابتلاء به آسم وجود ندارد ولی ژنوتیپ TT از چند شکلی های CAT C-262T با خطر ابتلاء به آسم در پیری در ارتباط است و احتمال آن را افزایش می دهد( Taniguchi N et al, 2014).
2-2 مطالعات انجام شده بر روی ژن :NQO1 مطالعهای درسال 2003 توسط Lin P و همکارانش در ارتباط با بررسی چند شکلی های ژنتیکی در ژنهای NQO1، GSTP1 و Mn-SOD با خطر ابتلا به سرطان ریه در تایوان انجام شد، نشان داد که به طور کلی چند شکلی GSTP1 با خطر ابتلا به سرطان ریه در ارتباط می باشد. افراد حامل آلل نوع GSTP1 در معرض خطر بالای سرطان سلولهای سنگفرشی ریه هستند (Lin P et al, 2003).
در مطالعهای که توسط Pandith A و همکارانش در سال 2011 در جمعیت کشمیری بر روی ارتباط بین چند شکلی ژنتیکی C609T NQO1 و سرطان مثانه انجام شد، نشان داد که آلل T خطر ابتلا به سرطان مثانه را افزایش میدهد .(Pandith A et al, 2011)
مطالعهای دیگر در سال 2011 توسط Stavropoulou C و همکارانش در ارتباط با چند شکلی C609T NQO1 و خطر ابتلا به بیماری های آلزایمر و پارکینسون انجام گرفت که در آن آلل T خطر ابتلا به این بیماری ها را افزایش میداد.(Stavropoulou C et al, 2011)
متا آنالیزی در سال 2012 توسط Zhang و همکارانش در رابطه با چند شکلیNQO1 C609T و خطر ابتلا به سرطان معده در آسیاییها انجام شد. نتایج حاصل از مقایسه آلل T و آلل C این ژن نشان داد که در افراد دارای آلل T نسبت به افراد دارای آلل C، به طور قابل توجهی شانس ابتلا به سرطان معده افزایش مییابد .(Zhang Y et al, 2012)
متا آنالیزی در سال 2013 توسط Zhu CL و همکارانش در رابطه با چند شکلیC609T NQO1 با سرطان دستگاه گوارش (DTC) انجام شد که نشان داد که به طور کلی از لحاظ آماری ارتباط معنی داری بین چند شکلی این ژن و خطر DTC وجود دارد (Zhu CL et al, 2013).
در سال 2013 توسط Hu Yanlig و همکارانش متا آنالیزی در ارتباط با بررسی چند شکلیC609T NQO1 و خطر ابتلا به سرطان مری انجام شد که نتایج بدست آمده نشان داد که ارتباط معنیداری بین ژنوتیپ TT از چند شکلی C609T NQO1 و سرطان مری وجود دارد (Yanlig H et al, 2013).
مطالعهای در سال 2013 توسط Liu و همکارانش در بررسی ارتباط چند شکلی عملکردی NQO1 C609T و خطر ابتلا به سرطان سلولهای کبدی در جمعیت چین انجام شد. نتایج نشان داد در افرادی که ژنوتیپ TT دارند در مقایسه با افراد دارای ژنوتیپ CC به طور قابل توجهی خطر ابتلا به سرطان سلولهای کبدی افزایش مییابد (Liu F et al, 2013).
2-3 مطالعات پیشین انجام شده در خصوص پیوند کبد:بررسی ها نشان می دهد که ارتباط معنی داری بین نوع بیماری و خطر رد حاد پیوند وجود دارد و افراد دارای بیماری PBC، هپاتیت B و هپاتیت C به علت ضعیف بودن سیستم ایمنی کمتر از سایر بیماران به رد حاد پیوند کبد مبتلا می شوندSeiler, 1999, Farges, 1996, Berlakovich., 2011) ) همچنین Wiensner و همکارانش در سال 1998 ارتباط معنی داری بین میزان بالای ALT ، نوع بیماری، رژیم درمانی و سن بیمار با رد حاد پیوند کبد مشاهده کردند. در سال 2010Azarpira, و همکارانش گزارش کردند که ارتباطی بین چند شکلی ژن های GSTM1 و GSTT1و خطر رد حاد پیوند وجود ندارد اما رابطه معنی داری با افزایش سن بیماران مشاهده کردند.
در مطالعه ای که در سال 2010 در نیویورک توسط Navdeep Dhillon و همکارانش بر روی ارتباط رد پیوند کبد با چند شکلی در ژن گیرنده TLR4 صورت گرفت رابطه معنا داری بین این چند شکلی و رد پیوند کبد مشاهده گردید( Dhillon N et al, 2010).
در مطاله دیگر که در اسپانیا و در سال 2011 توسط M.J. Citores و همکارانش انجام شد، ارتباط رد حاد پیوند کبد در بیماران پیوند کبدی که به علت آلودگی با ویروس هپاتیت C مجبور به پیوند کبد شده اند با ده چند شکلی در ژن گیرنده TLR(TLR1-10) مورد بررسی قرار گرفت که نتایج حاصل نشان داد که تنها چند شکلی در ژن TLR3 با رد حاد پیوند کبد در ارتباط است ( Citores M et al, 2011).
طی مطالعه ای که در سال 2013 در چین توسط Zhijun Jiang و همکارانش انجام شد رابطه چند شکلی آنتی ژن 4 لنفوسیت T کشنده(CTLA-4) با خطر رد حاد پیوند کبد مورد بررسی قرار گرفت که نتایج آن نشان داد که این چند شکلی رابطه معناداری با رد حاد پیوند کبد ندارد ( Jiang Z et al, 2013).
در سال 2012 در ایتالیا توسط Bitetto D و همکارانش مطالعه ای در بین افرادی که بافت کبد پیوندی دریافت کرده بودند برای یافتن ارتباط بین رد حاد پیوند کبد با چند شکلی در ژن انترلوکین28(IL-28B) انجام دادند. نتایج این بررسی نشان داد که اختلاف معناداری در بین افرادی که بافت کبد پیوندی آنها رد شده و آنهایی که رد حاد صورت نگرفته در ژنوتیپ اینترلوکین28 وجود دارد ( Bitetto D et al, 2012).
در سال 2013 در نیویورک توسط Sridhar R. Allam و همکارانش بررسی برای یافتن ارتباط بین بقای بافت پیوندی در افراد دریافت کننده پیوند کبد با چند شکلی در ژن اینترلوکین 28(IL-28B) صورت گرفت که طی آن مشخص شد ارتباط معنا داری وجود دارد و حضور آلل C باعث افزایش بقای بافت کبد پیوندی در گیرندگان کبد می شود ( Allam RS et al, 2013).
Xiaobo Yu و همکارانش در سال 2014 در چین به بررسی ارتباط چند شکلی فاکتور 5 تنظیمی اینترفرون(IRF5) و رد حاد پیوند کبد پرداختند که در این رابطه به این نتیجه دست یافتند که چند شکلی در این ژن ارتباط معنا داری با رد حاد پیوند کبد دارد و ژنوتیپ GG در معرض ریسک رد حاد پیوند کبد می باشد ( Yu X et al, 2014).
Uesugi M و همکارانش در سال 2014 در ژاپن مطالعه ای برای یافتن ارتباط بین رد حاد پیوند کبد و چند شکلی در ژن سیتوکروم P450(CYTP3A5) انجام دادند. طی این مطالعه مشخص شد که ارتباط معناداری بین این چند شکلی و خطر رد حاد پیوند کبد وجود ندارد ( Uesugi M et al, 2014).
فصل سوم
روش کار3-1 نمونه گیری:در این طرح، مطالعه بر روی 217 نفر از بیماران پیوند کبد در مرکز پیوند بیمارستان نمازی شیراز طی سالهای 93-1392 انجام شد که از این تعداد 144 نمونه خون کامل و 73 نمونه بافیکت بود. DNA را از نمونههای خون به روش Boiling و از نمونههای بافیکت با استفاده از کیت DNP متعلق به شرکت سیناژن استخراج کردیم. نمونههای کنترل نیز به تعداد 217 نمونه در این مطالعه وارد گردید. در نهایت یک مطالعه مورد-شاهدی بین افراد سالم و بیماران پیوند کبد و یک مطالعه آینده نگر(Cohort) بین بیماران پیوند دارای رد حاد و فاقد رد حاد انجام شد. جدول 3-1مشخصات این بیماران را نشان میدهد. در این مطالعه رد حاد پیوند به افرادی اطلاق میگردد که در طول 6 ماه اول پیوند با بیوپسی (نمونه برداری از بافت) رد حاد آن ها تایید شدهاست.
جدول3-1: مشخصات گروه شاهد و کنترل
مشخصات سالم بیماران پیوند کبد
تعداد کل
میانگین سن 217
31/10 ±09/30 217
26/18±55/33
3-2 وسایل مورد نیازوسایل استفاده شده در این پروژه شامل:
سمپلر(Socorex)، ترازو، میکرو سانتریفیوژ (Hettich)، ورتکس (Scientific industries INC)، اتوکلاو (ریحان طب)، مایکروفر (بوتان)، دستگاه ترموسایکلر (Techne)، Hot plate(Techne)،Rotator (پدیده نوژن پارس)، PH-meter(Metrohm)، Electrophoresis (تانک الکتروفورز و منبع تغذیه جریان الکتریکی پایامقاله)، دستگاه Gel documentation(UvitecCambridge).
3-2-1 محلولهای استفاده شده جهت استخراج DNA از نمونه خون کاملمحلولهای استفاده شده شامل:
NaOH (50 میلی مولار)، TrisHCl (1 مولار)، محلول NH4Cl (170 میلی مولار)، محلول NaCl-EDTA (10 میلی مولار) می باشد که از طریق روش گفته شده در کتاب Molecular Cloning: A Laboratory Manual تهیه شدند (Green MR et al, 2012).
3-2-2 محلولهای استفاده شده جهت استخراج DNA از نمونه بافی کتپروتئاز mg/ml 20 (proteinase K)، Lysis Solution، Wash Buffer (Ethanol Base) Precipitation Solution(Isoprppanole Base)،Solvent Buffer
3-2-3 مواد لازم جهت انجام PCRTaq DNA Polymerase (سیناژن)، dNTPs (سیناژن)، MgCl2 (سیناژن)، بافر 10x(10x buffer) مخصوص PCR(سیناژن) و پرایمر های رفت و برگشت ژن CAT و NQO1 (سیناژن)
3-2-4 مواد لازم جهت انجام الکتروفورزبافرTBE، محلول اتیدیوم بروماید (x1000)، Tris Base (سیناژن)، Boric acid (Merck)، EDTA (Merck) 6xloading buffer (سیناژن)، Agarose(Invitrogen)، 100bp DNA ladder (Vivantis).
3-2-5 مواد استفاده شده جهت اثر دادن آنزیم محدود کنندهآنزیم محدود کنندهHinf1 و EcoRV(Fermentas) و بافرEcoRV و بافرv3
3-3 استخراج DNA از خون محیطیاستخراج DNA از خون کامل به روش جوشاندن (Boiling) انجام شد که جزئیات روش کار طبق موارد گفته شده در منبع مورد نظر میباشد (Newton CR et al, 1995).
3-4 استخراج DNA از بافی کت با کیت DNP1- 5 میکرولیتر پروتئاز را روی 100 میکرولیتر از نمونه بافی کت ریخته و آن را به مدت 10 ثانیه ورتکس میکنیم سپس لوله ها را به مدت 10 دقیقه درون Hot plate در دمای72 درجه سانتیگراد قرار میدهیم.
2- بعد از بیرون آوردن لوله ها از Hot plate در دمای72 درجه، 400 میکرولیترLysis Solution ریخته و به مدت 20- 15 ثانیه ورتکس میکنیم تا یک سوسپانسیون کاملا هموژن بدست آید.
3- به محلول فوق 300 میکرولیتر از Precepitation Solution اضافه کرده و برای 5 ثانیه ورتکس میکنیم، سپس لوله ها درون سانترفیوژ با دور g 12000به مدت 10 دقیقه قرار میدهیم.
4- بعد از بیرون آوردن از سانترفیوژ محلول رویی لوله ها را خالی کرده و لوله ها را روی یک دستمال به مدت 3-2 ثانیه قرار میدهیم.
5- لوله ها را برگردانده و به هر کدام 1 میلی لیتر از Wash Buffer اضافه کرده و به مدت 5-3 ثانیه ورتکس کرده و مجددأ درون سانترفیوژ با دورg 12000 این بار به مدت 5 دقیقه قرار میدهیم.
6- بعد از اتمام زمان سانترفیوژ مایع رویی را خالی کرده و رسوب ته لوله را نگه داشته و برای اینکه Wash Buffer درون لوله ها کاملا خشک شود آن ها را به مدت 5 دقیقه درون Hot plate 65 درجه قرار میدهیم.
7- بعد از خشک شدن لوله ها آن ها را بیرون آورده و 30 میکرولیتر از Solvent Buffer اضافه کرده لوله ها را به آرامی تکان میدهیم و مجددأ درون Hot plate 65 درجه قرار میدهیم به مدت 5 دقیقه تا رسوب ته لوله که همان DNA است به خوبی حل شود. DNA بدست آمده را در دمای 20- درجه سانتیگراد نگهداری می کنیم.3-5 PCRاز واکنش زنجیرهای پلیمراز جهت تعیین ژنوتیپهای چندشکلی ژنتیکی ژنهایCAT C-262T و NQO1 C609T استفاده کردیم. برای انجام این کار مواد مورد نیازی که در بالا ذکر شد را از فریزر 20- درجه سانتیگراد بیرون میآوریم. بعد از آب شدن مواد در دمای اتاق جهت درست کردن میکس آنزیم آنها را روی یخ قرار می دهیم. جهت تهیه 20 میکرولیتر مخلوط واکنش به ازای هرلوله، مواد مورد نیاز را طبق جدول 3-2 با هم مخلوط میکنیم.
جدول 3-2: مواد مورد نیاز جهت تهیه مخلوط واکنش PCRاجزای واکنش حجم مورد نیاز به ازای هر واکنش (μl)
10x PCR buffer 5/2

 برای دانلود فایل کامل به سایت منبع مراجعه کنید  : omidfile.com

یا برای دیدن قسمت های دیگر این موضوع در سایت ما کلمه کلیدی را وارد کنید :

 

dNTP (10 mM) 5/0
MgCl2 (50 mM) 75/0
10) پرایمر رفتμM( 1
10)پرایمر برگشتμM( 1
Taq DNA polymerase 3/0
آب استریل 95/13
DNA --plate 5
پرایمرهای رفت و برگشت مورد استفاده جهت تکثیر قطعه مورد نظر از ژنNQO1:
Forward primer 5’-TCC TCA GAG TGG CAT TCT GC-3’
Reverseprimer 5- TCT CCT CAT CCT GTA CCT CT-3’
(Sameer AS et al, 2010)
پرایمرهای رفت و برگشت مورد استفاده جهت تکثیر قطعه مورد نظر از ژن CAT :
Forward primer 5’-CTGATAACCGGGAGCCCCGCCCTGGGTTCGGATA-3’
Reverse primer 5’-CTAGGCAGGCCAAGATTGGAAGCCCAATGG-3’
(Zarbock R et al. 2007)
بعد از اینکه مخلوط واکنش را آماده کردیم در هر لوله 20 میکرولیتر از مخلوط ریخته و به آن 5 میکرولیتر DNA الگو اضافه میکنیم. برای انتقال قطرات چسبیده به دیواره به ته لوله، به مدت چند ثانیه spin down میکنیم و در دستگاه PCR قرار میدهیم. جهت انجامPCR از مراحل آورده شده در جداول 3-3 و3-5 استفاده میکنیم.
جدول 3-3: برنامه تنظیم شده برای واکنش PCRجهت تکثیر ژن NQO1مرحله دما(°C) زمان
دناتوراسیون اولیه 94 7 دقیقه
41سیکل دناتوراسیون 94 30 ثانیه
اتصال 58 30 ثانیه
طویل شدن 72 30 ثانیه
بسط نهایی 72 5 دقیقه
در ژن NQO1 محصول PCR یک قطعه 230 جفت بازی است. پس از پایان PCR، به 10 میکرولیتر از محصول PCR، 2 میکرولیتر از بافرV3و 25/0 میکرولیتر (معادل 5 واحد) از آنزیم HinfI اضافه کرده و لوله ها را به مدت 17 ساعت درون Hot plateدر دمای 37 درجه سانتیگراد قرار میدهیم. پس از گذشت مدت زمان لازم، نمونهها را از Hot plate خارج کرده، به منظور جمع آوری قطرات Spin down میکنیم و جهت تفکیک قطعات DNA حاصل از هضم آنزیمی، آن را به دستگاه الکتروفورز منتقل میکنیم.
پس از هضم آنزیمی توسط آنزیم HinfI قطعات bp 200 برای ژنوتیپ CC و قطعات bp151 و bp49 نمایانگر ژنوتیپ TT وقطعات bp200، bp151 و bp 49 نشان دهنده ژنوتیپ CT بدست میآید.
جدول 3-4: قطعات حاصل از هضم آنزیمی برای ژنوتیپ های چندشکلی ژنتیکی NQO1ژنوتیپ قطعات (جفت باز)
CC 200
CT 49، 151، 200
TT 151،49
جدول 3-5: برنامه تنظیم شده برای واکنش PCRجهت تکثیر ژن CATمرحله دما (°C) زمان(دقیقه)
دناتوراسیون اولیه 95 5
35 سیکل دناتوراسیون 94 1
اتصال 68 1
طویل شدن 72 1
بسط نهایی 72 5
در ژن کاتالاز قطعات DNA حاصل از PCR190 جفت بازی میباشند. پس از پایان PCR، به 10 میکرولیتر از محصول PCR، 2 میکرولیتر از بافر EcoRVو 25/0 میکرولیتر (معادل 5 واحد) از آنزیم EcoRV اضافه کرده و لوله ها را به مدت 16 ساعت در Hot plateدر دمای 37درجه سانتیگراد قرار میدهیم. پس از پایان این مدت زمان، نمونهها راخارج کرده، Spin down میکنیم و به الکتروفورز منتقل میکنیم. ژنوتیپ TT این چندشکلی، جایگاهی برای برش توسط آنزیم EcoRV ندارد. بنابراین، باند 190 جفت بازی نشان دهنده آلل موتانت این چند شکلی است. ژنوتیپ CC توسط آنزیم EcoRV برش خورده و دو قطعه 157 و 33 جفت بازی بوجود میآید. قطعات حاصل از هضم آنزیمی برای ژنوتیپ های این چند شکلی در جدول 3-6 نشان داده شدهاند.
جدول 3-6: قطعات حاصل از هضم آنزیمی برای ژنوتیپ های چندشکلی ژنتیکی CATژنوتیپ قطعات
TT 190
CT 33، 157، 190
CC 157،33
3-6 الکتروفورزبه منظور مشاهده قطعات DNA حاصل از هضم، جهت تعیین چندشکلی ژنتیکی CAT C-262TوNQO1 C609T، آنها را به ژل 5/1 % آگاروز منتقل میکنیم. برای تهیه ژل 5/1 %، 72/1 گرم پودر آگاروز را با 115 سی سی TBE 0.5x مخلوط کرده و با قرار دادن شانه درون ژل چاهک درست میکنیم. پس از سرد شدن ژل و خارج کردن شانه مواد حاصل از هضم آنزیمی را با x Loading 6 مخلوط و به چاهک ها منتقل میکنیم در یکی از چاهکها bp DNA Ladder100 به عنوان نشانگر طول قطعات میریزیم و با برقراری جریان الکتریکی قطعات DNA حاصل براساس اندازه خود در طول ژل از قطب منفی به مثبت دستگاه الکتروفورز حرکت کرده و از هم جدا میشوند.
3-7 رنگ آمیزی ژلبه منظور اینکه قطعات DNA روی ژل آگاروز قابل رؤیت شود، ژل را از دستگاه الکتروفورز بیرون آورده و به مدت 10الی 15 دقیقه درون ظرف حاوی اتیدیوم بروماید (µg/ml1) قرار میدهیم، پس از آن ژل را درون دستگاه Gel documentation قرار داده و با روشن کردن نور UV از آن عکس گرفته و مشاهده میکنیم.

شکل 3-1: نتایج حاصل از PCR –RFLP چند شکلی ژنتیکی CAT C-262Tبر روی ژل آگاروز
شکل 3-2: نتایج حاصل از PCR -RFLP چند شکلی
ژنتیکی NQO1 C609T بر روی ژل آگاروز3-7 تحلیل آمارینتایج حاصل از مطالعه که برروی بیماران پیوند کبد و چندشکلی ژنهای CAT وNQO1 انجام گرفت بانرمافزار SPSS، با به کارگیری روش کای اسکور (x2) و آنالیز آماری رگرسیون لوجستیک و آزمون t-test با در نظر گرفتن سطح معنیداری ٠۵/٠P< مورد تجزیه و تحلیل قرار دادیم.
فصل چهارم
نتایج4-1 مشخصات افراد شرکت کننده در این مطالعهدر این مطالعه 217 نفر از بیماران پیوند کبد با میانگین سنی 2/18±5/33 مورد بررسی قرار گرفتند. در میان بیماران پیوند کبد 47 بیمار با میانگین سنی 2/16±7/36 با رد حاد پیوند کبد و 170 بیمار با میانگین سنی 7/18±6/32 بدون رد حاد پیوند بودهاند. همچنین 217 نفر افراد سالم با میانگین سنی 3/10 ±0/30 به عنوان گروه کنترل مورد استفاده قرار گرفت.
4-2 نتایج حاصل از بررسی ریسک فاکتور های دخیل در رد پیوند کبد و مشخصات بیمارانآنالیز عوامل خطر مانند جنسیت پذیرنده و دهنده بافت، گروه خونی، سن گیرنده ودهنده بافت بین گروههای بیمار دارای رد حاد و فاقد رد حاد پیوند تفاوت معنی داری از لحاظ آماری نشان نداد. )05/0<P) آنالیز عوامل خطر از طریق تست رگرسیون لوجستیک انجام گرفت.
جدول 1-4 بررسی ریسک فاکتورهای دخیل در رد پیوند کبد و مشخصات بیمارانفاکتور مورد مطالعه فاقد رد پیوند حاد (n=170)(%) دارای رد پیوند حاد (n=47)(%) OR CI%95 P-value
جنسیت گیرنده
مرد (61) 104 (66) 31 1 زن (39) 66 (34) 16 813/0 41/0-60/1 550/0
جنسیت دهنده مرد (58) 100 (74) 35 1 زن (42) 70 (26) 12 042/2 99/0-20/4 053/0
گروه خونی O (38) 65 (28) 13 1 A (29) 50 (34) 16 60/1 70/0-20/3 261/0
B (29) 48 (34) 16 66/1 73/0-20/3 223/0
AB (4) 7 (4) 2 42/1 26/0-20/7 677/0
RH مثبت (88) 149 (93) 44 1 منفی (12) 21 (7) 3 48/0 13/0-69/1 257/0
جدول 2.4- بررسی ریسک فاکتورهای کمی دخیل در رد پیوند کبد و مشخصات بیمارانفاکتور مورد مطالعه فاقد رد پیوند حاد دارای رد پیوند حاد df t-test P-value
میانگین سن پذیرنده بافت
میانگین سن دهنده بافت 7/18±66/32
8/14±73/30 2/16±76/36
8/13±39/33 215
192 364/1-
059/1- 174/0
291/0
4-3 نتایج حاصل از بررسی چند شکلی ژن CAT درافراد سالم و بیماران پیوند کبدفراوانی ژنوتیپهای سه گانهCC، CT و TT ژنCAT در گروه سالم به ترتیب: 9/64 %، 2/29 % و 9/5 % و در بیماران پیوند کبد به ترتیب: 2/58 %، 4/35 % و 4/6 %بدست آمد. فراوانی آللهای C و T در افراد سالم به ترتیب: 79/0 و 21/0 و در بیماران پیوند کبد: 76/0 و 24/0 است. (جدول 3-4) در جمعیت سالم تعادل هاردی- واینبرگ را مورد بررسی قرار دادیم که نشان دهنده نرمال و در تعادل بودن جمعیت بود(P>0.05، df=1، X2=1.45).
جدول 4-3 مقایسه ژنوتیپ های ژن کاتالاز در گروه سالم و بیمار پیوند کبدسالم N(%) پیوند کبد N(%)
ژنوتیپ ها CC (65) 141 (58) 126
CT (30) 63 (36) 77
TT (5) 13 (6) 14
آلل C (79) 345 (76) 329
T (21) 89 (24) 105
4-4 مقایسه ی فراوانی ژنوتیپی و آللی بین دو گروه سالم و بیمار در ژن کاتالازبا استفاده از آنالیز آماری رگرسیون لوجستیک مقایسه فراوانیهای ژنوتیپی و آللی ژن CAT بین دو گروه سالم و بیماران پیوند کبد انجام شد.
جدول 4-4 آنالیز توزیع فراوانی های ژنوتیپی و آللی ژن کاتالاز در بین گروه سالم و بیماران پیوند کبدسالم بیماران پیوند کبدی OR
CI95% P-value
ژنوتیپ CC 141 126 1 - -
CT 63 77 36/1 06/2-90/0 135/0
TT 13 14 20/1 66/2-54/0 644/0
CT+TT 76 91 34/1 10/2-50/0 139/0
آلل C 345 329 1 T 89 105 237/1 70/1-89/0 193/0
4-5 مقایسه ی فراوانی ژنوتیپی و آللی بین بیماران با رد حاد پیوند و بیماران فاقد رد حاد پیوند در ژن کاتالازمقایسه فراوانیهای ژنوتیپی و آللی بین دو گروه بیماران با رد حاد و فاقد رد حاد پیوند در ژن CAT انجام شد. که در هیچ یک ارتباط معنیداری مشاهده نشد (05/0<P).
جدول 4-5 آنالیز توزیع فراوانی های ژنوتیپی و آللی در ژن کاتالاز در بین بیماران پیوند کبدفاقد رد پیوند حاد N(%) دارای رد پیوند حاد N(%) OR CI95% P-value
ژنوتیپ CC (9/55)95 (0/66)31 1 CT (0/37)63 (8/29)14 681/0 33/0-38/1 287/0
TT (1/7)12 (2/4)2 511/0 10/0-40/2 396/0
CT+TT (1/44)75 (0/34)16 654/0 33/0-28/1 217/0
آلل C (2/58)253 (5/69)76 1 T (8/41)87 (5/30)18 689/0 39/0-21/1 199/0
4-6 نتایج حاصل از بررسی چند شکلی ژن NQO1 درافراد سالم و بیماران پیوند کبدمطابق با جدول 4-6 فراوانی آلل های C و T ژن NQO1 در افراد سالم به ترتیب: 73/0 و 27/0 و در گروه بیمار به ترتیب: 75/0 و 25/0 بدست آمد. فراوانی ژنوتیپهای CC، CT وTT در افراد سالم به ترتیب: 5/52 % ، 5/40 % و 9/6 % و در گروه بیمار پیوند کبد به ترتیب: 9/53 %، 4/41 % و 6/4 % بود و در بررسی گروه سالم مشاهده شد که جمعیت از تعادل هاردی- واینبرگ تبعیت میکند(P>0.05، df=1، X2=3.25).
جدول 4-6 مقایسه ژنوتیپ های ژن NQO1 در گروه سالم و بیمار پیوند کبدسالم N(%) پیوند کبد N(%)
ژنوتیپ ها CC (53) 114 (54) 117
CT (40) 88 (41) 90
TT (7) 15 (5) 10
آلل C (73) 316 (75) 324
T (27) 118 (25) 110
4-7 مقایسه ی فراوانی ژنوتیپی و آللی بین دو گروه سالم و بیمار ژن NQO1با استفاده از آنالیز آماری رگرسیون لوجستیک مقایسه فراوانیهای ژنوتیپی و آللی ژن NQO1 بین دو گروه سالم و بیماران پیوند کبد انجام شد.
جدول 4-7 آنالیز توزیع فراوانی های ژنوتیپی و آللی ژنNQO1 در بین گروه سالم و بیماران پیوند کبدسالم
بیماران پیوندی OR CI95% P-value
ژنوتیپ CC 114 117 1 CT 88 90 997/0 67/0-43/1 986/0
TT 15 10 650/0 28/0-50/1 314/0
CT+TT
103 100 946/0 64/0-37/1 773/0
آلل C 316 324 1 T 118 110 100/1 48/1-81/0 537/0
با توجه به نتایج بدست آمده در جداول فوق، ارتباط معنیداری بین فراوانی آللها و ژنوتیپهای ژن NQO1 وCAT در جمعیت سالم و بیماران پیوندی مشاهده نشد. این مشاهده حاکی از آن است که ژن های NQO1 و CAT دربروز بیماری کبدی منجر به پیوند نقشی ندارد.
4-8 مقایسه ی فراوانی ژنوتیپی و آللی بین بیماران با رد حاد پیوند و بیماران فاقد رد حاد پیوند در ژن NQO1مقایسه فراوانیهای ژنوتیپی و آللی بین دو گروه بیماران با رد حاد و فاقد رد حاد پیوند در ژن NQO1 انجام شد. که در ژن هیچ یک ارتباط معنیداری مشاهده نشد (05/0<P) . ولی هنگامی که حداقل حضور یک آلل C یعنی مجموع دو وضعیت CC و CT را نسبت به حالت TT مورد بررسی قرار دادیم اختلاف معنی داری دیده شد. و نشان داده شد که حالت TT می تواتد باعث افزایش خطر رد حاد پیوند کبد به میزان 92/3 برابر شود(92/3OR=، 08/1-20/14CI=، 037/0P=).
جدول 4-8 آنالیز توزیع فراوانی های ژنوتیپی و آللی در ژن NQO1 در بین بیماران پیوند کبدفاقد رد پیوند حاد N(%) دارای رد پیوند حاد N(%) OR CI95% P-value
ژنوتیپ CC (7/51)88 (7/61)29 1 CT (2/45)77 (6/27)13 51/0 24/0-05/1 069/0
TT

پاسخ دهید

نشانی ایمیل شما منتشر نخواهد شد. بخش‌های موردنیاز علامت‌گذاری شده‌اند *